Diagnostika MMR deficience, MSI a MMR zárodečné mutace

V případě klinicko-patologického podezření na MTS jsou nezbytná další laboratorní vyšetření k potvrzení nebo vyloučení MMR deficience a MSI. Sensitivita vyšetření nestability mikrosatelitů založená na PCR metodě versus imunohistochemické vyšetření je shodná. Prvním krokem skríningového testu je imunohistochemická studie exprese MMR proteinů, která představuje rychlou, efektivní a spolehlivou metodu s vysokou prediktivní hodnotou diagnózy MMR deficience [42]. Patern exprese MMR proteinů v kožních tumorech koreluje s molekulárně-genetickými výsledky. Ztráta exprese těchto proteinů je indikátorem pravděpodobného zárodečného defektu MMR genů a s tím spojené MSI (obr. 12) [42]. V naší rutinní praxi používáme standardně panel čtyř protilátek (MLH1, PMS2, MSH2, MSH6), ačkoliv nedávné studie poukázaly na možnost použití pouze dvou-protilátkového panelu (MSH6 a PMS2), jehož prediktivní hodnota je údajně shodná jako vyšetření s použitím 4 protilátek vezmou-li se v úvahu biochemické vlastnosti MMR proteinů, které tvoří výše zmíněné heterodimery MLH1/PMS2 a MSH2/MSH6 [48]. MLH1 a MSH2 jsou tzv. základní proteiny, zatímco PMS2 a MSH6 představují tzv. sekundární proteiny. Abnormality v základních proteinech (MLH1, MSH2) vedou k proteolytické degradaci heterodimerů a následně ke ztrátě jak základních, tak sekundárních proteinů. Jestliže se mutace vyskytne v genech sekundárních proteinů (geny PMS2, MSH6), heterodimery zůstávají stabilní a nedochází k současné ztrátě jejich partnerů, tj. základních proteinů. Proto v případě použití dvou-protilátkového panelu je třeba mít vždy na mysli, že většina případů se ztrátou MSH6 proteinu může mít defekt v MSH2 genu, zatímco u případů se ztrátou PMS2 proteinu může být naopak genetický defekt v MLH1 genu. Jestliže je využito 4-protilátkového panelu, často je ztráta MLH1 nebo MSH2 spojena ztrátou PMS2 a MSH6 proteinu.

Několik postřehů k imunohistochemickému vyšetření exprese MMR proteinů vedoucí ke stanovení nebo vyloučení MMR deficience:

Sporadické sebaceózní léze mohou příležitostně také demonstrovat ztrátu MMR proteinů [49, 50].
Někteří pacienti mohou mít zárodečnou mutaci, která se neprojevuje ztrátou MMR proteinů v tumoru. Taková situace může nastat u některých zárodečných missense mutací vedoucí k expresi nefunkčních, ale antigenně intaktních proteinů. [51, 42].
U různých sebaceózních tumorů jednoho pacienta je očekáván identický barvící patern. Z tohoto důvodu postačí k testování osob s mnohočetnými projevy na kůži jen jedna léze [10, 40]. Je však třeba zdůraznit, že sebaceózní hyperplazie obyčejně nevykazuje ztrátu MMR proteinů, ačkoliv ostatní typy sebaceózních tumorů u téhož jedince (např. sebaceózní adenom, sebaceózní karcinom) simultánně demonstrují MMR deficienci [10]. Předpokládaným nálezem je taktéž imunohistochemická shoda mezi všemi tumory od jednoho pacienta včetně kožních a viscerálních tumorů, avšak vzácně může být u kožních a viscerálních tumorů detekován rozdílný patern imunohistochemického vyšetření MMR proteinů [52].
Pomocí imunohistochemického vyšetření nelze rozlišit mezi ztrátou MLH1 exprese způsobené zárodečnou mutací versus somatickou hypermethylací promotoru [51].
Známým a často diskutovaným faktem je existence několika kvalit barvení včetně tzv. slabého barvení neoplastických elementů a nedostatku přesvědčivé pozitivní interní kontroly. Někteří autoři zastávají názor, že jenom kompletní ztráta exprese MMR proteinu v tumorózní tkáni s validní pozitivní kontrolou může být považována za interpretativní. Podle našich zkušeností je možné zaznamenat parciální ztrátu exprese MMR proteinu, někdy s nápadným gradientním profilem (tj. ztráta barvení v centru léze s naopak pozitivním, i když jen slabě, barvením na periferii tumoru) [42]. V problematických případech je doporučováno vyhodnocení vzorku nejméně dvěma patology, kteří mají zkušenosti s interpretací imunohistochemických nálezů MMR proteinů. I přesto se vzácně vyskytnou případy s nevyhodnotitelným výsledkem imunohistochemického vyšetření (tzv. neinterpretovatelný barvící patern) [53].

MSI může být detekována pomocí PCR technik a fragmentační analýzy zjišťující délku určitého segmentu DNA v lezionální tkáni a srovnávající ji se stejnými segmenty v normální tkáni přilehlé k tumoru. Pro tyto účely je nutná ve formolu fixovaná tkáň a dále pro dermatopatologickou praxi toto vyšetření předpokládá využití mikrodisektoru k obdržení optimálního výsledku. Snadnější a z praktického hlediska výhodnější alternativou získání kontrolního vzorku je odběr periferní krve pacienta (5-10 ml), která může být také použita pro detekci zárodečné mutace. Současně nejvíce používaný panel mikrosatelitních markerů zahrnuje D2S123, D5S346, D17S250, BAT25, BAT26 (viz. tabulka 2). V naší praxi navíc používáme i NR21, NR24, a MONO27. Výsledkem analýzy mohou být dva fenotypy MSI, a to mikrosatelitní nestabilita vysokého (high degree of MSI; MSI-H) (obr. 13) a nízkého stupně (low degree of MSI; MSI-L) [54]. Zatímco MSI-H u sporadických sebaceózních kožních lézí a u sebaceózní hyperplazie je detekována pouze vzácně, u ostatních kožních lézí pacientů s MTS je častým nálezem [54, 39, 34, 52].

Zárodečná mutace v MMR genech může být detekována u pacienta a jeho pokrevních příbuzných mnoha metodami, např. testem na přítomnost zkrácených proteinů (protein truncation test), analýzou konformačního polymorfizmu jednořetězcových segmentů (single strand conformation polymorphism analysis, SSCP), analýzou heteroduplexů. U pacientů s MTS je zárodečné mutace v MMR genech detekována v 60 – 70 % [34, 3]. Na našem pracovišti je používána PCR metoda s následnou přímou sekvenací korespondujících PCR fragmentů sloužící k detekci malých mutací (obr. 14) a MPLA (multiplex ligation-dependent probe amplification) umožňující detekci rozsáhlých delecí a duplikací. Součástí genetického vyšetření je i test na onkogenní V600E (dříve známý jako V599E) hotspot mutaci v genu BRAF. Tato metoda spolu s vyšetřením MSI byla nedávno přidána k prospektivnímu skríningu pacientů s kolorektálním karcinomem, u kterých bylo vysloveno podezření na HNPCC/Lynchův syndrom. BRAF mutace je identifikovaná ve významné části kolorektálních karcinomů s MSI-H s hypermethylací MLH1 promotoru (tzv. sporadické karcinomy), ale není přítomna u tumorů s MSI vznikajících v rámci HNPCC/Lynchova syndromu. Zjednodušeně lze shrnout, že identifikace V600E BRAF mutace prakticky vylučuje možnost HNPCC/Lynchova syndromu, a lze ji proto použít před samotným testováním zárodečné mutace v MLH1 genu u kolorektálních karcinomů s MSI-H [55].